【学习笔记】新冠变异株疫苗及广谱疫苗研究
冠状病毒科（Coronaviridae）是一类导致哺乳动物和鸟类疾病的相关RNA病毒，可引起人和鸟类从轻微到致命的呼吸道感染。冠状病毒科共有4个病毒属，分别为Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus和Deltacoronavirus，其中Betacoronavirus（Group 2 CoV）又分为subgroup/subgenera A（Embecovirus），B（Sarbecovirus），C（Merbecovirus），D（Nobecovirus），近些年新增了Hibecovirus亚属。2002-2004年大流行的SARS-CoV，以及当前的SARS-CoV-2均属于Betacoronavirus的lineage B—Sarbecovirus[1]。
🚧SARS-CoV-2的诸多变异株是全球防疫的主要阻力，导致接种人群中的突破性感染增加。WHO 将变异株分为三类：variants of concern(VOCs)、variants of interest(VOI) 和variants under monitoring (VUM)。 前四种 VOCs 包括 Alpha (B.1.1.7)、Beta (B.1.351)、Gamma (P.1) 和 Delta (B.1.617.2)。 2021年11月26日，WHO确认Omicron（B.1.1.529）为第五种VOC，与野生型(WT)相比，Omicron在其刺突蛋白上携带多达30个单点突变、3个缺失突变和1个插入突变。在Omicron受体结合域(RBD)中观察到15个突变，其中10个位于与人类血管紧张素转换酶2 (ACE2)和大多数单克隆抗体(mab)直接相互作用的受体结合基序(RBM)中【SARS-CoV-2 Omicron RBD shows weaker binding affinity than the currently dominant Delta variant to human ACE2】。
🍕2021年12月Nature连发数刊，发现COVID-19的大多数治疗性抗体和天然抗体对omicron株的效力均大幅降低。
🔴高福院士团队基于此前ZF2001新冠重组蛋白二聚体疫苗的研发平台，设计开发了prototype-beta以及delta-omicron二聚体疫苗。序列来源如下，prototype SARS-CoV-2 (GenBank: YP_009724390), Beta variant (GISAID: EPI_ISL_736940) and Delta variant (GenBank: OK091006.1)。为了蛋白的分泌，每个抗原的N端均连接了MERS-CoV的S蛋白的信号肽（1-17氨基酸残基）；为了便于后续纯化，C端引入了hexa-His标签。序列均进行过哺乳动物细胞表达密码子优化，由金唯智合成，克隆入pCAGGS载体，并转染Expi293F细胞，5天后收获上清并纯化。
在进行制备临床前研究及临床试验所需的GMP级样品时，RBD二聚体疫苗采用CHO-K1制备，仍保留信号肽序列，但删除了C端的标签，由安徽智飞龙科马完成纯化。同时Prototype-beta嵌合dimer为一个prototype RBD（S蛋白的R319-K537残基）和一个Beta RBD（S蛋白的V320-K537残基）连接，为避免潜在的蛋白酶切割，删去了R319。
🔴蓝鹊/上海复旦预印本：抗原突变设计如下，其中粉色来源于B.1.1.7 variant，蓝色来源于B.1.351 variant，红色为共有，标*的位点同时也存在于B.1.1.529 variant。另外，弗林酶切割位点RRAR替换为GSAS，并删除了末端18个氨基酸。目前mRNA疫苗RQ3013已进入一期临床。
🔴中科大王育才团队设计的两款新冠mRNA疫苗相关成果已上传预印本，分别是与BNT162b2序列相同的基于野毒株设计的S_WT-2P mRNA疫苗，以及基于Omicron株设计的S_Omicron-6P mRNA疫苗。S_WT-2P在WA1株（GenBank MN908947.3）的Spike全长基础上，设计了2个脯氨酸突变即K986P和V987P，来稳定spike的融合前构象。S_Omicron-6P抗原设计序列基于omicron株（B.1.1.529，GISAID: GR/484A）的Spike引入了6个脯氨酸突变，分别为F817P, A892P, A899P, A942P, K986P和V987P。Jason S. McLellan团队2013年即发现通过设计突变，将RSV的F protein锁定在融合前构象可显著提高其诱导中和抗体水平的能力。该团队2020年在Science发表文章Structure-based design of prefusion-stabilized SARS-CoV-2 spikes，设计了6个脯氨酸突变的HexaPro，提升了Spike在哺乳动物细胞中的产量和稳定性，通过电镜证实了该设计能够将Spike稳定的锁定在融合前构象，从而增强其诱导中和抗体水平。
该研究在假毒和真毒上分别进行了中和抗体滴度测定，结果表明，Omicron-6P诱导针对Omicron的中和抗体水平（NT50/VNT50）优于当前已获批的新冠灭活疫苗及亚单位疫苗。
该研究对免疫两针的叙利亚仓鼠进行Omicron攻毒实验，并分别通过RT-qPCR和空斑实验检测其鼻腔、左右肺的病毒载量，结果表明Omicron-6P可有效保护仓鼠感染Omicron株，且疫苗诱导仓鼠产生的中和抗体与接种剂量表现出良好的相关性。但攻毒后的RT-qPCR检测鼻腔病毒载量数据表明，仅50μg的剂量免疫可显著降低仓鼠鼻腔中的病毒载量，采用空斑实验检测鼻腔中的病毒载量的检出量与RT-qPCR数据明显不符。
该研究分别给恒河猴接种了20μg和100μg的Omicron-S6P mRNA疫苗，发现单针接种该疫苗时，仅有1只高剂量组的恒河猴血清针对Omicron假毒的中和抗体阳转，但第二针接种后7天，两种剂量的所有血清针对多种变异株的中和抗体水平均显著提升。该研究给预防新冠变异株的免疫接种策略提供了临床前的数据支持，即两剂Omicron特异性的mRNA疫苗能提供针对omicron株较高滴度的抗体水平和良好的保护效果。
🔴耶鲁大学医学院基于Omicron BA.1（GISAID EpiCoV: EPI_ISL_6826713 and EPI_ISL_6826714）全长Spike抗原，引入了HexaPro的S 6P突变位点来提高S蛋白的稳定性并维持融合前构象。S蛋白上的RRAR也突变为GSAS，从而使得S蛋白不被弗林蛋白酶切割为S1和S2。
初步免疫原性研究结果表明，该款omicron mRNA以10μg剂量间隔14天接种1针或2针均可诱导B6小鼠产生高滴度的omicron RBD结合抗体、假毒、活毒中和抗体，且2针接种免疫原性提升明显。
考虑到当前西方国家人口接种新冠疫苗主要以2针的WT mRNA疫苗为主，该团队进一步研究了WT和omicron的两针免疫、第三针heterologous、homologous booster的不同免疫方案，所诱导小鼠产生的对omicron、delta变异株的中和抗体水平差异。结果表明，①与WA1和Delta RBD相比，WT mRNA-LNP诱导的针对Omicron RBD的结合抗体滴度在35天和>3.5个月时明显较弱，中和抗体水平已下降至PBS基线水平。②序贯接种omicron mRNA疫苗可显著提升针对omicron、delta株的中和抗体水平，针对omicron提升更为显著。
这篇文章对于制备工艺的介绍也相对详细，Hiscribe T7 ARCA mRNA Kit （with talling，NEB，Cat#E2060S），50% N1甲基化假尿嘧啶，mRNA -80℃保存，制剂采用加拿大的Precision Nanosystems公司的Ignite微流控设备，脂质混合物组分为 46.3% ALC-0315 (MedChemExpress, HY-138170), 1.6% ALC-0159 (MedChemExpress, HY-138300), 9.4% DSPC (Avanti polar lipids, 850365 P), and 42.7% Cholesterol (Avanti polar lipids, 700100 P)。 水相为25mM pH5.2的醋酸钠溶液，LNP：mRNA摩尔比为6:1。通过100kDa Amicon filter（Macrosep，Centrifugal Devices 100K，89131-992）换液为蔗糖PBS溶液。
was mixed with prepared mRNA in 25 mM sodium acetate at pH 5.2 on Ignite instrument at a molar ratio of 6:1 (LNP: mRNA
🔴艾博生物👬军科院秦成峰团队Letter：基于ARCoV mRNA疫苗平台，快速开发针对omicron株的mRNA疫苗，从omicron RBD序列到第一手动物免疫原性数据仅用时32天。ARCoV-Omicron作为加强针免疫可诱导小鼠产生针对omicron高水平的中和抗体，且对WT的中和抗体水平更高，相对primary immunization中和抗体水平提升十分显著。
🔴上海巴斯德研究所黄忠团队设计了分别编码SARS-CoV-2 WT株和omicron株RBD的mRNA疫苗，采用了IL-10的信号肽序列。IL-10
免疫原性研究结果表明，WT RBD疫苗针对Dleta株的中和抗体水平有所下降，但针对omicron株的中和抗体水平大幅下降至较低水平。omicron RBD疫苗针对omicron株的中和抗体较高，但无法提供针对WT和delta株的中和作用。
🔴新加坡杜克-国立大学王林发团队在NEJM上发表文章，对新加坡既往感染过SARS-CoV-1、SARS-CoV-2的康复者血清，以及接种新冠mRNA疫苗BNT162b2的健康人血清进行了中和抗体研究。
该研究发现，感染过SARS-CoV-1康复者者接种BNT162b2，可诱导产生针对10种**sarbecovirus的中和抗体。该研究提供了新的免疫接种策略–单剂量加强接种不同分支冠状病毒疫苗：比如先接种SARS-CoV-2疫苗，加强针接种SARS-CoV-1疫苗，可诱导产生针对Pan-Sarbecovirus中和抗体。**
