HPLC定量脂质体组分中DOTAP含量

HPLC定量脂质体组分中DOTAP含量

脂质体被广泛应用于mRNA疫苗、DNA疫苗、核酸药物中。阳离子脂质具有带正电荷的头部，能够与带有负电荷的核酸静电吸附，通过与其他脂质体的协同作用将核酸包封在脂质体混合物内部，能够提高核酸的稳定性，促进核酸进入细胞内发挥表达、干扰等作用。

在将阳离子脂质体与DNA、RNA混合之前，准确测定每个脂质体成分的浓度是至关重要的，以确保脂质体制剂的高重复性。另外，质控、放行阶段也需要对成品进行脂质体组分的鉴别和定量。

📭有文章公开了采用HPLC（二极管阵列检测器）检测脂质体DOTAP的方法[Meyer et al. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 2000]。方法描述为：

使用反相C18 LC ABZ1plus 柱（25 x 0.46 cm，5 μm；Supelcosil，Supelco，Bellefonte，PA）搭配HP1090 HPLC系统（Hewlett-Packard Co.，Camas）。并在进样器和分析柱之间安装了一个防护柱（Supelguard ABZ 1 plus，2 cm，Supelco，货号# 59535-U）。每个脂质体制备的10μL样品与50mL的溶液A（0.15％TFA水溶液）和60mL的溶液B（0.05％TFA异丙醇溶液）稀释。脂质使用线性梯度进行上样和洗脱，从50％流动相A和50％流动相B的开始，10分钟内达到100％流动相B，保持10分钟的100％流动相B，然后在2分钟内返回到初始流动相比例。所有运行都在室温下进行，流速为0.5 ml/min，两个连续运行之间间隔10分钟。使用二极管阵列检测器（PAD）在205 nm处进行紫外检测。标准曲线的配制方法：将脂质体粉末称量后，DOPE和DOTAP使用异丙醇溶解，胆固醇使用甲醇溶解，pcTG90使用乙醇/水 (90/10)溶解。

这种方法能够很好的将pcTG90/DOPE, DOTAP/Chol分开，标曲可信性强。

📝关于脂质体pcTG90。

该脂质体的合成发表于1999年*[Nazih et al. Tetrahedron Letters 1999]。在2000年报道与DOPE混合使用能够有效递送表达IFN-β的DNA质粒，优选配方为pcTG90:DOPE=摩尔比1：2，N/P=10[Meyer et al. Gene Ther 2000]*。

泰国朱拉隆功大学研究人员参考相似的方法用于测定本团队研发的新冠DNA疫苗的DOTAP含量*[Peletta et al. Vaccines 2021]*，方法描述如下：

使用Waters Acquity系统（Milford，MA，USA），该系统配备了二元溶剂输送泵、样品管理器、自动进样器、柱加热舱和光电二极管阵列（PDA）检测器。分离是在XBridge（伦敦，英国）C18，3.5μm，2.1 x 100mm柱上进行，柱温40°C。脂质采用二元线性梯度进行洗脱，从50％流动相A和50％流动相B开始，1.88分钟内达到100％B，并保持100％流动相B2.08分钟。其中A为0.15％（v/v）三氟乙酸（TFA）水溶液，B为0.05％（v/v）TFA异丙醇溶液。然后将流动相组成更改回初始溶剂混合物。流动相的流速设定为0.2 mL/min。注射样品直接在异丙醇中稀释。使用从1 mg/mL到0.015 mg/mL的DOTAP标准品按1:1稀释步骤建立校准曲线。使用PDA检测器在205 nm波长处进行紫外检测。通过测量曲线下面积（AUC）来计算DOTAP的浓度。