Considerations for the development of LNP using microfluidics
LNP递送系统在预防性核酸疫苗研发、肿瘤治疗等领域进展迅猛，临床和真实世界数据结果优异，具有广阔的应用前景。LNP包封技术虽然可追溯较早，但也是近几年才迎来蓬勃发展，关于LNP制剂工艺方面的文章很少，各公司的工艺技术也都是高度保密内容。
加拿大的Precision nanosystems公司在MDPI-Pharmaceutics上发表了一篇研究论文，为研究LNP制剂过程中各参数、处方对结果的影响，研究者分别采用两种阳离子脂质（DOTAP、DOAB）和两种可离子化脂质（MC3、GenVoy-ILM-iLNP），分别包封聚腺苷酸（poly A)，单链DNA，mRNA ，探讨了总流速TFR、流速比FRR、脂质组分的摩尔比等对包封产物的粒径，PDI，Zeta点位及包封率的影响。
文章主要方法参数如下：水相的缓冲液主要采用pH6 100mM的柠檬酸缓冲液，在缓冲液的探讨部分引入了TRIS进行对比。采用透析的方法进行纯化，cLNPs用TRIS缓冲液透析，iLNPs用PBS透析。
总流速（total flow rate，TFR）增大（5-20ml/min），粒径减小，在总流速为10-20ml/min时粒径趋于稳定，但PDI始终维持在0.2以下，且纯化对粒径没有影响。【👀Note：①此处纯化方法为透析，透析介质分别为pH 7.4的TRIS和pH 7.3的PBS，所以在纯化过程中应伴随着pH的升高，是否会影响离子化脂质带正负电荷的情况和对核酸的包封效率②为何cLNP与iLNP的透析介质不同？③除了粒径，流速是否影响包封率？】
流速比（flow rate ratio,FRR）增大（1：1-1：5），粒径减小，具体来看，应是在FRR在1：3及1：5时为理想范围内的粒径大小，且PDI也显著收紧。其中，MC3-LNP在FRR1：1在透析后粒径由200nm上升至接近700nm，PDI也明显增大，但实际操作中很少会采用1：1FRR。【🙋♂️：是否与N/P有关】
摩尔比对粒径及zeta点位的影响。LNP通常由四种组成成分，分别为阳离子脂质（或可离子化脂质）、胆固醇、磷脂及PEG。阳离子脂质（或是可离子化脂质）能够促进与带负电荷的核酸的静电相互作用，并且在内体逃逸中发挥重要作用。磷脂（如DSPC）具有较高的转变温度，能够增加膜的刚性，降低膜的渗透性。当胆固醇含量较低时（<10 molar%），PDI较高；当提高胆固醇含量，同时降低阳离子脂质的含量，PDI显著降低，同时粒径减小；当胆固醇含量提高至50%时，纯化前后粒径大小保持一致，但从图上看，PDI也显著增加，但基本可保持在0.2以下。相比较而言，MC3-LNP对胆固醇含量的变化并不敏感，且PDI始终在0.2以下，性质较为稳定。
脂质组分及缓冲液的影响。HSPC替代DSPC，DMG-PEG2000替代DSPE-PEG200均为观察到粒径PDI及Zeta电位有显著改变。相比之下，缓冲液对于包封产物特征的影响则更大。从图中可以看到，采用10mM pH7.4的TRIS缓冲液，DOTAP-cLNP的粒径只有25nm，PDI也较大。但使用100mM pH6.0的柠檬酸缓冲液，DOTAP-cLNP的粒径~50nm，PDI显著降低。
