【学习笔记】mRNA原液的制备工艺和质量控制

mRNA疫苗的生产工艺主要有DNA原液的制备，mRNA原液的制备，以及制剂包封、灌装等。原液是mRNA疫苗制备的第一环节，主要工艺环节包括将线性化质粒DNA转录为mRNA，化学修饰，分离纯化，mRNA原液分装冻存。与灭活疫苗、减毒活疫苗、腺病毒载体疫苗路线不同，mRNA疫苗的制备过程不涉及病毒的培养，除去菌种发酵，也无其他环节涉及细菌的培养。

当前主流是采用体外转录（IVT)方法，通过RNA聚合酶识别启动子，进行RNA合成。为降低mRNA的体内免疫原性，需在5‘UTR的上游加上Cap结构，常采用酶法（牛痘病毒加帽酶）或是共转录法完成。poly A尾也同样可通过加尾酶或是共转录，加到序列的3’末端，对mRNA的稳定性和半衰期有显著改善作用，从而提高翻译效率。整个过程用到多种原料酶、buffer等，可能存在残留污染；转录过程也将产生多种副产物，如dsRNA，CAP0或无CAP，转录提前终止，过度延伸产生长片段等，因此需要在原液生产阶段就进行严格的质量控制。

这篇博客主要总结一下个人在原液环节遇到的一些问题，以及制备和质控过程中的一点心得。

1.菌种筛选中poly A尾丢失的问题。

在之前几个mRNA项目中，菌种poly A尾丢失的问题很是麻烦，通过转化多个感受态细胞，降低培养温度，再测序验证仍然无法有效解决，筛选到高比例保留A尾长度的菌种概率很低。再后来，直接将菌液进行涂布平板——挑克隆——测序，A尾的长度仍然只有15A~30A。

诺唯赞公司生物医药部门研发经理金博的一场线上分享会，介绍了mRNA原液的生产和质控内容，分享了很多他们在实验中摸索得出的具有借鉴意义的数据。写个博客mark一下~

在这场直播分享中，不少听众也提出A尾丢失的问题，但最终金博也没能给出行之有效的解决方法，说到底，还是多挑克隆——筛！但金博提到，用PCR快速粗略检测A尾长度的方法：在A尾上下游设计一对引物，对质粒或者菌液进行PCR扩增，再进行电泳验证。这个方法没有测序条件的实验室就可以完成，不一定再初期筛选阶段就大规模的送测序筛选，一来浪费经费，二来外包测序耗费时间较长，等结果回来菌液生长活性已经降低，不能直接冻菌保存，再次活化又可能导致复制不完全的问题。

但PCR测A尾也会有问题，比如poly结构PCR保真性低，扩增的腺苷酸个数难以反映真实值，A尾差异也就是几十到一百之间，电泳检测分辨率较低。通过PCR反应体系（比如dNTP的比例，buffer等）和反应条件的优化，聚合酶的选择，引物和扩增片段的优化，电泳缓冲液和凝胶的筛选，或是通过DNA毛细管电泳（Q-Sep，安捷伦2100/5300），可建立起利用PCR法进行A尾长度的粗略检测，在前期筛选过程中，应用场景广泛。当前已有专利和文章以及产品可实现PCR法检测poly A尾长度。

另一方面，优化A尾的设计也是行之有效的方法，BioNTech专利公布了不连续PolyA尾设计，如30A+Linker+70A，A40L60，A60L60。该方法显著提高了mRNA的表达效率，体现在更高的体内和体外活性。

当前polyA尾测定的金标准仍是LC-MS法。诺华公司公开发表了这一方法专利

RNase T1特异地作用于鸟嘌呤3’端磷酸，切割位点在鸟嘌呤的3’磷酸和相邻核苷酸的5‘羟基之问的磷酸二酯键，反应终产物为3’鸟苷酸和末端带3’鸟苷酸的寡核苷酸片段。原液经RNase T1切割后，采用poly A富集试剂盒可将原液种不同长度的poly A尾富集，再进行液质联用分析，从而计算不同长度的比例。

2.IVT反应产物的纯化：

IVT反应体系中含有大量的盐离子、dNTP、酶、cap-analog等杂质，需要经过一步纯化。实验室小试阶段，能够制备mg级mRNA原液，足够做一批动物实验，可采用微柱纯化、磁珠法、层析等对IVT反应产物进行纯化，以获得高纯度的mRNA原液。微柱法的纯化能力受限于单个微柱的承载量，一般在10μg-50μg左右，实际操作中需要分成若干个微柱同时进行，操作起来比较麻烦，但回收率较高。磁珠法可根据反应体系或预估产物量按比例扩大磁珠用量，在不同规格的磁力架上可单管操作，较为方便。产物wash步骤常采用70%-80%乙醇或是异丙醇，醇相比例太高将导致盐离子、蛋白等沉淀吸附，杂质洗涤不完全，而比例太低又将导致RNA的洗脱，回收率降低。在最终洗脱时，可采用无菌无酶水，或是TE溶液进行洗脱，预热洗脱液有利于RNA的溶解。还可采用Oligo-dT亲和层析法进行粗纯，进一步采用RP-HPLC精纯。另外有研究表明，mRNA原液在纯化过程中，除了目的ssRNA的纯度提升，dsRNA含量也会降低。mRNA原液不稳定，长期保存需-80℃冻存。洗脱完成后可使用商品化或根据经验配制的保存溶液对原液进一步稀释，降低RNA在冻融过程中造成的水解或断裂。

3.双链RNA（dsRNA）杂质干扰

dsRNA可被TLR3、RIG I、melanoma differentiation-associated gene 5 (MDA5)等分子识别，激活TRIF和MAVS分子。进一步介导IFN-1和促炎细胞因子的分泌，从而激活下游信号通路，参与抗病毒免疫蛋白基因的表达，将影响mRNA疫苗的体内表达活性。

有研究表明，dsRNA主要有2种形成机理：一种是RNA聚合酶在不依赖于T7 promoter的情况下，由3‘end错误启动，这种情况可通过poly(A/T)的序列设计来避免；另一种更易发生，在转录完成之后，RNA聚合酶未从模板解离，而是以转录产物为模板继续合成。

dsRNA含量可通过均相时间分辨荧光（HTRF）或是ELISA法进行定量分析。两种方法均利用了d2和EU两种抗体，通过标准曲线对dsRNA进行定量。其中，HTRF技术为法国CISBIO公司产品专利，结合了荧光共振能量转移和时间分辨荧光，与ELISA法相比，其操作相对快速，省去了包被和洗板的过程。

4.修饰核苷的问题

修饰核苷对mRNA疫苗质量提升至关重要，假尿苷化修饰是RNA中普遍存在的一种转录后修饰，是表观遗传学的重要组成，由假尿苷合酶家族PUS实现对RNA上的特异性尿苷位点进行修饰。针对核苷酸的修饰方式目前主要有以下几种：假尿苷（pseudouridine, ψ）、N1-甲基假尿苷（N1-methylpseudouridine, m1ψ）、5-甲氧基尿苷（5-methoxyuridine, mo5U）、2-硫代尿苷（2-thiouridine, s2U）、5-甲基胞苷（5-methylcytidine，m5C）和N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine, m6A）等。有研究表明修饰核苷替代后，mRNA翻译效率将显著提高。目前IVT反应常采用 m1ψ来100%替代dUTP，以提高mRNA疫苗在体内的稳定性。